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实际上，达·芬奇对这一题材已经构思了多年。他从1478年起，就一直在探索如何对这一主题进行表现，并为此画了许多草图，直到1495年接受订约，他仍然觉得思考得不够成熟，并继续进行大量的工作。因此，他一方面认真研究前人的作品，尤其是佛罗伦萨画家卡斯塔尼奥的《最后的晚餐》，给了他很大的启发；另一方面，他仔细地研究了画中13个人物各自的身份、年龄、性格和经历，并猜测和想象他们在当时的各种反应。
为了积累素材，达·芬奇经常一个人跑到各式各样的人群中去，仔细地观察，并且快速地记下他们的特征，或者当场画下速写，然后再回去细加推敲。
他非常注意研究人物的动作、表情、姿态。他告诉学生们：“要记住，绘画里最重要的，就是每一个人物的动作都应该表现出他的精神状态。一个用动作最完美地表达出了他的热情的人物，是最值得赞许的。此外，应该悄悄地观察旁人漫不经心的、自然的动作，用几根线条简要地勾画下来，别让他察觉，否则会引起他们的注意，以至于他们所做的动作全都失去了全神贯注时所表现出来的那种劲头……”
此外，达·芬奇还考虑到了对整幅绘画的总体构图。以前的画家都是将犹大放在画的一边，将其他人放在另一边，这样，画面就处理得非常机械，很难真正体现出犹大作为隐藏在信徒中的叛徒的阴暗灵魂。达·芬奇在进行整体构图时就想到：一定要打破这种传统的做法，把这12门徒进行重新组合，既要显示个体特征，又要注意到整体的和谐与场面的戏剧性。
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